文/Andrey Andreev

雙光子顯微成像是一種熒光成像技術(shù)，其應(yīng)用日趨成熟。在雙光子熒光顯微成像裝置中，最昂貴的設(shè)備是飛秒激光器，而大多數(shù)生物學(xué)家對此激光技術(shù)并不熟悉。雙光子熒光顯微成像中最常用是波長可調(diào)的鈦藍(lán)寶石（Ti：sapphire）激光器，其價(jià)格高達(dá)20萬美元。好消息是，目前市場上已經(jīng)有更便宜、更小巧的固定波長的光纖激光器，能夠適用于雙光子熒光成像。

鈦藍(lán)寶石激光器和光纖飛秒激光器用于成像的性能非常相似。^[1]目前，有十幾家公司可以提供用于雙光子顯微成像的激光源。隨著激光參數(shù)的增多，購買者往往很難做出決定。本文主要介紹鈦藍(lán)寶石激光器和光纖激光器的哪些參數(shù)對成像實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，從而幫助研究人員選擇合適的激光器。

飛秒激光器與生物發(fā)現(xiàn)

有多種類型的顯微成像實(shí)驗(yàn)有賴于飛秒激光器。本文重點(diǎn)關(guān)注利用雙光子熒光成像技術(shù)和光遺傳學(xué)技術(shù)對小鼠的深腦成像和對斑馬魚的全腦成像。熒光蛋白和光學(xué)門控離子通道的吸收光譜通常位于近紅外波段，為900~1100nm。 波長較長的光波穿透能力強(qiáng)，散射低，其光波肉眼不可見，因此可以用于透明動物的光敏實(shí)驗(yàn)。單光子成像的光功率一般為微瓦量級，而雙光子熒光需要的激光功率高達(dá)百毫瓦量級。并且激光能量越高，生物組織的雙光子吸收效率就越高，因此需要使用短脈沖光源，如飛秒激光器。

在雙光子熒光成像實(shí)驗(yàn)中，研究人員一般使用波長可調(diào)范圍為700~1000 nm的鈦藍(lán)寶石激光器。鈦藍(lán)寶石激光器大約誕生于1986年，目前多家公司都能提供。根據(jù)激光器的不同波長，選擇相應(yīng)的熒光團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)多色成像，也可以實(shí)現(xiàn)諸如新熒光團(tuán)設(shè)計(jì)之類的光譜學(xué)應(yīng)用。

目前在雙光子顯微成像中使用最多的光源就是鈦藍(lán)寶石激光器。 但是鈦藍(lán)寶石激光器本身具有很多不足之處，如單價(jià)高于12萬美元、整個(gè)系統(tǒng)尺寸很大、重量重，以及與成像系統(tǒng)配合使用時(shí)無法靈活移動。此外，由于一般實(shí)驗(yàn)室平均每年的設(shè)備費(fèi)預(yù)算只有10萬美元左右，因此很少有實(shí)驗(yàn)室會購買鈦藍(lán)寶石激光器這樣高價(jià)的設(shè)備。

單波長飛秒激光器是在2004年左右出現(xiàn)的一種新技術(shù)，其特點(diǎn)是只能輸出固定波長的光。除了波長不能調(diào)諧外，其輸出光的特性與鈦藍(lán)寶石激光器類似，并且激光器的體積更小，價(jià)格更便宜，起價(jià)約4萬美元。單波長飛秒激光器由于體積小、運(yùn)行方式更加節(jié)能，因此利用空氣冷卻取代了傳統(tǒng)的水冷（如圖1）。但是，目前關(guān)于這款激光器的使用經(jīng)驗(yàn)還比較少，在運(yùn)行穩(wěn)定性和售后服務(wù)方面都存在不足。

圖1：左右圖分別為鈦寶石超快激光器和其電源。其中藍(lán)綠色激光器對應(yīng)藍(lán)綠色電源；橙色激光器對應(yīng)橙色電源。從圖中可見，波長固定的超快激光器（橙色）比波長可調(diào)的超快鈦藍(lán)寶石激光系統(tǒng)（藍(lán)綠色）更加緊湊。因此，在雙光子顯微應(yīng)用中，研究人員在選擇激光器時(shí)必須考慮到每種激光器的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1：用于雙光子成像的激光器選擇

激光器參數(shù)的選擇

雙光子成像與激光器的多個(gè)參數(shù)有關(guān)（見表2）。第一個(gè)參數(shù)，也是最重要的一個(gè)參數(shù)是波長，常用的熒光蛋白如GFP和GCaMP，其激發(fā)波長為920~940nm，而紅移熒光蛋白其激發(fā)波長為1040~1100 nm。

表2：熒光蛋白對應(yīng)的雙光子激發(fā)波長

此外，在雙光子熒光成像和光遺傳學(xué)應(yīng)用中，還必須考慮激光功率，這是第二個(gè)參數(shù)。激光器制造商一直致力于提高激光功率輸出，但在實(shí)際的成像實(shí)驗(yàn)中，可能并不需要如此高的功率。激光點(diǎn)掃描熒光成像技術(shù)需要波長為920nm、功率為10~100mW的激光，而激光層照熒光顯微技術(shù)則可能需要500mW的功率。因此，即使考慮到50％損耗，所需的激光功率也不會超過1~2W。對于高功率激光器，可以將其光源分束，供兩三臺顯微成像設(shè)備同時(shí)使用。波長可調(diào)的激光器在其可調(diào)波長范圍內(nèi)具有非恒定功率輸出。例如，在920nm處輸出功率為2W，而在1040nm處輸出功率僅1W。

影響成像質(zhì)量的第三個(gè)參數(shù)是激光的脈沖寬度，因?yàn)檩^短的脈沖可以更有效地產(chǎn)生熒光信號。^[2]用于成像的飛秒激光的脈沖寬度通常為80~200fs。影響成像質(zhì)量的第四個(gè)重要參數(shù)是激光的重復(fù)頻率，一般使用的重復(fù)頻率為80MHz。在相同的平均功率下，較低的重復(fù)頻率可以產(chǎn)生更有效的熒光激發(fā)。^[3]因此，較低的重復(fù)頻率和較短的脈沖寬度使成像組織的光損傷較小，具體實(shí)例參照斑馬魚的實(shí)驗(yàn)。^[4]

在快速掃描成像中，僅使用幾個(gè)脈沖即可生成單個(gè)圖像像素（如共振掃描儀成像），因此需要激光器提供更高的單脈沖能量。平均功率和單脈沖能量的關(guān)系式如下：

平均功率 = 脈沖能量 × 重復(fù)頻率

為實(shí)驗(yàn)選擇合適的激光光源的難點(diǎn)在于，對于波長可調(diào)的激光器，其激光參數(shù)是相互關(guān)聯(lián)的。波長越長，穿透就越深。然而，平均功率和脈沖寬度是波長的函數(shù)，因此無法使所有參數(shù)達(dá)到最優(yōu)。固定波長激光器其參數(shù)出廠時(shí)就已經(jīng)設(shè)定好，因此參數(shù)不可調(diào)。

激光器的選配模塊

除了激光光源本身，激光系統(tǒng)通常還與其他選配模塊一起使用。

有些公司將功率調(diào)節(jié)模塊與激光器集成到一起，可以實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)激光功率，這一點(diǎn)對雙光子顯微成像特別重要。但是，一些功率調(diào)節(jié)系統(tǒng)會產(chǎn)生高達(dá)25％的功率損耗，因此用戶在選擇的時(shí)候，要考慮到損耗的存在。目前，使用最普遍的普克爾盒（Pockels cell），能將功率損耗降到約2％~5％，成本約為1~1.5萬美元，但是依然需要額外的電子控制系統(tǒng)配合其工作。

另一個(gè)比較有效選配模塊是內(nèi)置預(yù)補(bǔ)償。由于色散，光脈沖在穿過光學(xué)元件時(shí)會產(chǎn)生脈沖展寬。初始脈沖寬度為60fs的脈沖激光通過顯微鏡的光學(xué)元件后，其脈寬會展寬到300fs，這就會使雙光子的熒光信號降低50%。預(yù)補(bǔ)償可以抵消色散效應(yīng)。激光器內(nèi)置了預(yù)補(bǔ)償，通過計(jì)算機(jī)控制，可以對眾多元件如物鏡和反射鏡等進(jìn)行色散補(bǔ)償。定制化的預(yù)補(bǔ)償光學(xué)系統(tǒng)需要專業(yè)人員設(shè)計(jì)，例如使用一對啁啾鏡可以實(shí)現(xiàn)色散補(bǔ)償，其成本約為3000美元。

由于購買集成的預(yù)補(bǔ)償和功率調(diào)節(jié)系統(tǒng)成本較高，有人可能認(rèn)為用戶自行采購元器件組裝可以節(jié)省成本。但是，應(yīng)該考慮到，集成系統(tǒng)的價(jià)格不只包括元器件本身的價(jià)格，還包括人工和時(shí)間成本、使用界面的友好性及產(chǎn)品的耐用性等。

對于鈦藍(lán)寶石激光器，其僅有的一個(gè)選配模塊是雙通道輸出，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)700~1000nm可調(diào)波長輸出和1040nm的固定波長輸出。因此可以同時(shí)對激發(fā)波長不同的兩種熒光蛋白如綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）成像。如果選擇固定波長的激光器做同樣的實(shí)驗(yàn)，則需要兩臺激光器同時(shí)工作。鈦藍(lán)寶石激光器雙通道輸出選配模塊中，固定波長輸出通道沒有色散預(yù)補(bǔ)償，或者只有出廠設(shè)定的預(yù)補(bǔ)償值。

如何購買激光器

用戶在購買激光器時(shí)與銷售的溝通可能不太順暢。買家應(yīng)向激光器專業(yè)銷售詳細(xì)咨詢激光器的技術(shù)信息，包括激光光譜和脈沖形狀（FROG測量）、其他配件的參數(shù)、冷卻系統(tǒng)詳細(xì)工作過程、功率大小、環(huán)境溫度要求，以及是否需要安裝不間斷電源等。對于買家來說，最好與該公司近期內(nèi)的買家取得聯(lián)系，咨詢購買激光器的注意事項(xiàng)。最后，要咨詢激光器售后服務(wù)流程及費(fèi)用。通常，激光器出現(xiàn)小問題時(shí)公司可以遠(yuǎn)程解決；但是在激光器出現(xiàn)重大故障時(shí)，要求激光器公司能夠快速發(fā)出替代元件，確保激光器盡快恢復(fù)正常運(yùn)行。

如果研究人員的應(yīng)用非常明確，例如只對特定的熒光團(tuán)和光遺傳學(xué)分子成像，那么固定波長的激光器可能是不錯(cuò)的選擇。 但是，如果要對多種熒光團(tuán)激發(fā)成像，或者要為尚未深入研究的分子成像預(yù)留優(yōu)化空間，那么鈦藍(lán)寶石波長可調(diào)的激光器將是合適的選擇。

參考文獻(xiàn)：

1. J. M. Bueno, J. Ávila, and P. Artal, Appl. Opt., 58, 3830–3835 (2019); https://doi.org/10.1364/ao.58.003830.

2. C. Xu and W. W. Webb, J. Opt. Soc. Am. B, 13, 481–491 (1996); https://doi.org/10.1364/josab.13.000481.

3. G. Donnert, C. Eggeling, and S. W. Hell, Nat. Methods, 4, 81–86 (2007); https://doi.org/10.1038/nmeth986.

4. V. Maioli et al., bioRxiv (Jun. 3, 2020); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.02.130377v1.

5. J. B. Guild, C. Xu, and W. W. Webb, Appl. Opt., 36, 397–401 (1997); https://doi.org/10.1364/ao.36.000397.