文/Andrey Andreev

雙光子顯微成像是一種熒光成像技術，其應用日趨成熟。在雙光子熒光顯微成像裝置中，最昂貴的設備是飛秒激光器，而大多數生物學家對此激光技術并不熟悉。雙光子熒光顯微成像中最常用是波長可調的鈦藍寶石（Ti：sapphire）激光器，其價格高達20萬美元。好消息是，目前市場上已經有更便宜、更小巧的固定波長的光纖激光器，能夠適用于雙光子熒光成像。

鈦藍寶石激光器和光纖飛秒激光器用于成像的性能非常相似。^[1]目前，有十幾家公司可以提供用于雙光子顯微成像的激光源。隨著激光參數的增多，購買者往往很難做出決定。本文主要介紹鈦藍寶石激光器和光纖激光器的哪些參數對成像實驗至關重要，從而幫助研究人員選擇合適的激光器。

飛秒激光器與生物發(fā)現

有多種類型的顯微成像實驗有賴于飛秒激光器。本文重點關注利用雙光子熒光成像技術和光遺傳學技術對小鼠的深腦成像和對斑馬魚的全腦成像。熒光蛋白和光學門控離子通道的吸收光譜通常位于近紅外波段，為900~1100nm。 波長較長的光波穿透能力強，散射低，其光波肉眼不可見，因此可以用于透明動物的光敏實驗。單光子成像的光功率一般為微瓦量級，而雙光子熒光需要的激光功率高達百毫瓦量級。并且激光能量越高，生物組織的雙光子吸收效率就越高，因此需要使用短脈沖光源，如飛秒激光器。

在雙光子熒光成像實驗中，研究人員一般使用波長可調范圍為700~1000 nm的鈦藍寶石激光器。鈦藍寶石激光器大約誕生于1986年，目前多家公司都能提供。根據激光器的不同波長，選擇相應的熒光團，可以實現多色成像，也可以實現諸如新熒光團設計之類的光譜學應用。

目前在雙光子顯微成像中使用最多的光源就是鈦藍寶石激光器。 但是鈦藍寶石激光器本身具有很多不足之處，如單價高于12萬美元、整個系統(tǒng)尺寸很大、重量重，以及與成像系統(tǒng)配合使用時無法靈活移動。此外，由于一般實驗室平均每年的設備費預算只有10萬美元左右，因此很少有實驗室會購買鈦藍寶石激光器這樣高價的設備。

單波長飛秒激光器是在2004年左右出現的一種新技術，其特點是只能輸出固定波長的光。除了波長不能調諧外，其輸出光的特性與鈦藍寶石激光器類似，并且激光器的體積更小，價格更便宜，起價約4萬美元。單波長飛秒激光器由于體積小、運行方式更加節(jié)能，因此利用空氣冷卻取代了傳統(tǒng)的水冷（如圖1）。但是，目前關于這款激光器的使用經驗還比較少，在運行穩(wěn)定性和售后服務方面都存在不足。

圖1：左右圖分別為鈦寶石超快激光器和其電源。其中藍綠色激光器對應藍綠色電源；橙色激光器對應橙色電源。從圖中可見，波長固定的超快激光器（橙色）比波長可調的超快鈦藍寶石激光系統(tǒng)（藍綠色）更加緊湊。因此，在雙光子顯微應用中，研究人員在選擇激光器時必須考慮到每種激光器的優(yōu)缺點。

表1：用于雙光子成像的激光器選擇

激光器參數的選擇

雙光子成像與激光器的多個參數有關（見表2）。第一個參數，也是最重要的一個參數是波長，常用的熒光蛋白如GFP和GCaMP，其激發(fā)波長為920~940nm，而紅移熒光蛋白其激發(fā)波長為1040~1100 nm。

表2：熒光蛋白對應的雙光子激發(fā)波長

此外，在雙光子熒光成像和光遺傳學應用中，還必須考慮激光功率，這是第二個參數。激光器制造商一直致力于提高激光功率輸出，但在實際的成像實驗中，可能并不需要如此高的功率。激光點掃描熒光成像技術需要波長為920nm、功率為10~100mW的激光，而激光層照熒光顯微技術則可能需要500mW的功率。因此，即使考慮到50％損耗，所需的激光功率也不會超過1~2W。對于高功率激光器，可以將其光源分束，供兩三臺顯微成像設備同時使用。波長可調的激光器在其可調波長范圍內具有非恒定功率輸出。例如，在920nm處輸出功率為2W，而在1040nm處輸出功率僅1W。

影響成像質量的第三個參數是激光的脈沖寬度，因為較短的脈沖可以更有效地產生熒光信號。^[2]用于成像的飛秒激光的脈沖寬度通常為80~200fs。影響成像質量的第四個重要參數是激光的重復頻率，一般使用的重復頻率為80MHz。在相同的平均功率下，較低的重復頻率可以產生更有效的熒光激發(fā)。^[3]因此，較低的重復頻率和較短的脈沖寬度使成像組織的光損傷較小，具體實例參照斑馬魚的實驗。^[4]

在快速掃描成像中，僅使用幾個脈沖即可生成單個圖像像素（如共振掃描儀成像），因此需要激光器提供更高的單脈沖能量。平均功率和單脈沖能量的關系式如下：

平均功率 = 脈沖能量 × 重復頻率

為實驗選擇合適的激光光源的難點在于，對于波長可調的激光器，其激光參數是相互關聯(lián)的。波長越長，穿透就越深。然而，平均功率和脈沖寬度是波長的函數，因此無法使所有參數達到最優(yōu)。固定波長激光器其參數出廠時就已經設定好，因此參數不可調。

激光器的選配模塊

除了激光光源本身，激光系統(tǒng)通常還與其他選配模塊一起使用。

有些公司將功率調節(jié)模塊與激光器集成到一起，可以實時調節(jié)激光功率，這一點對雙光子顯微成像特別重要。但是，一些功率調節(jié)系統(tǒng)會產生高達25％的功率損耗，因此用戶在選擇的時候，要考慮到損耗的存在。目前，使用最普遍的普克爾盒（Pockels cell），能將功率損耗降到約2％~5％，成本約為1~1.5萬美元，但是依然需要額外的電子控制系統(tǒng)配合其工作。

另一個比較有效選配模塊是內置預補償。由于色散，光脈沖在穿過光學元件時會產生脈沖展寬。初始脈沖寬度為60fs的脈沖激光通過顯微鏡的光學元件后，其脈寬會展寬到300fs，這就會使雙光子的熒光信號降低50%。預補償可以抵消色散效應。激光器內置了預補償，通過計算機控制，可以對眾多元件如物鏡和反射鏡等進行色散補償。定制化的預補償光學系統(tǒng)需要專業(yè)人員設計，例如使用一對啁啾鏡可以實現色散補償，其成本約為3000美元。

由于購買集成的預補償和功率調節(jié)系統(tǒng)成本較高，有人可能認為用戶自行采購元器件組裝可以節(jié)省成本。但是，應該考慮到，集成系統(tǒng)的價格不只包括元器件本身的價格，還包括人工和時間成本、使用界面的友好性及產品的耐用性等。

對于鈦藍寶石激光器，其僅有的一個選配模塊是雙通道輸出，可以同時實現700~1000nm可調波長輸出和1040nm的固定波長輸出。因此可以同時對激發(fā)波長不同的兩種熒光蛋白如綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）成像。如果選擇固定波長的激光器做同樣的實驗，則需要兩臺激光器同時工作。鈦藍寶石激光器雙通道輸出選配模塊中，固定波長輸出通道沒有色散預補償，或者只有出廠設定的預補償值。

如何購買激光器

用戶在購買激光器時與銷售的溝通可能不太順暢。買家應向激光器專業(yè)銷售詳細咨詢激光器的技術信息，包括激光光譜和脈沖形狀（FROG測量）、其他配件的參數、冷卻系統(tǒng)詳細工作過程、功率大小、環(huán)境溫度要求，以及是否需要安裝不間斷電源等。對于買家來說，最好與該公司近期內的買家取得聯(lián)系，咨詢購買激光器的注意事項。最后，要咨詢激光器售后服務流程及費用。通常，激光器出現小問題時公司可以遠程解決；但是在激光器出現重大故障時，要求激光器公司能夠快速發(fā)出替代元件，確保激光器盡快恢復正常運行。

如果研究人員的應用非常明確，例如只對特定的熒光團和光遺傳學分子成像，那么固定波長的激光器可能是不錯的選擇。 但是，如果要對多種熒光團激發(fā)成像，或者要為尚未深入研究的分子成像預留優(yōu)化空間，那么鈦藍寶石波長可調的激光器將是合適的選擇。

參考文獻：

1. J. M. Bueno, J. Ávila, and P. Artal, Appl. Opt., 58, 3830–3835 (2019); https://doi.org/10.1364/ao.58.003830.

2. C. Xu and W. W. Webb, J. Opt. Soc. Am. B, 13, 481–491 (1996); https://doi.org/10.1364/josab.13.000481.

3. G. Donnert, C. Eggeling, and S. W. Hell, Nat. Methods, 4, 81–86 (2007); https://doi.org/10.1038/nmeth986.

4. V. Maioli et al., bioRxiv (Jun. 3, 2020); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.02.130377v1.

5. J. B. Guild, C. Xu, and W. W. Webb, Appl. Opt., 36, 397–401 (1997); https://doi.org/10.1364/ao.36.000397.